EndoLISA よくある質問(FAQ)

EndoLisaについて

Q1:EndoLISAはLALアッセイの有効な代替法ですか?

A1:
はい。EndoLISAはLALアッセイの有効な代替法です。
USP(米国薬局方)では、もし代替法が公定法と同等かそれ以上であり、
USP-33-NF28一般的注意:6.30 代替法、調和法及び手順に則り評価されている場合はその使用を認めています。

EndoLISAは外部のGLP認定会社で評価されておりその評価報告と認定はinfo@hyglos.deから入手できます。

注:代替法の検証のための要件はUSP 1225章に記載されています。
(またはICH Q2B分析手順の検証:方法)

Q2: EndoLISAはFDAに認可されていますか?

A2:
EndoLISAの製造には動物由来成分は使用されていません。
EndoLISAは生物学的製剤を一切含まないのと診断用途としての使用を意図していないのでFDAの認可は必要ありません。

Q3:EndoLISAはLALアッセイと同様に阻害物質に影響されますか?

A3:
EndoLISAの独創的な固相技術は試料中の干渉因子の除去を可能としていますので妨害効果を著しく低減します。
はじめに阻害/増強試験の評価をおすすめします。

Q4:測定をするのにどのような機器が必要ですか。?

A4:
①ボルテックスミキサー
②標準的なラボ用ピペッター
③マルチチャンネルピペット
④インキュベーター
⑤プレートシェーカー
⑥蛍光マイクロプレートリーダー(Biotek社FLx800,Ex380/20,Em440/40または同等品)
⑦検量線の作成、試料中のエンドトキシン濃度の計算のためのGen5ソフトウェアの利用を推奨
EndoLISAアッセイ用のテンプレートを用意しています。

Q5:ガラス器具またはプラスティック製品を使用すべきですか?

A5:
エンドトキシンはガラス表面よりプラスティック表面により強く吸着しますので
試料の調製、標準液の希釈にはガラス製のチューブのご利用を推奨します。
Hyglos社から適切な認定エンドトキシンフリーガラスチューブが購入できます。

Q6:カイネティックLALに使用しているマイクロプレートリーダーを利用できますか?

A6:
カイネティックLAL法では吸光リーダーを利用しています。
EndoLISAでは蛍光基質を 用いていますので蛍光プレートリーダーが必要です。
Biotek社のFLx800をおすすめします。

Q7:EndoLISA測定に必要な蛍光リーダーのフィルター波長はいくつですか?

A7:
EndoLISAは以下のフィルターで開発、評価されました。
励起フィルター(nm/バンド幅):380/20
吸収フィルター(nm/バンド幅):440/40

Hyglos社では以下のフィルターでの組み合わせもテストしました。

Hyglosy社でのフィルターテスト

Q8:キットで何回測定できますか?

A8:
EndoLISAキットには96ウェルのマイクロプレート2枚が含まれていますので192測定できます。
EndoLISAプレートはひとつ16ウェルの6個のストリップに分割できますので
試料が少ないときにはプレートすべてを使用する必要はありません。

Q9:1回の測定で何検体の試料が測定できますか?

A9:
EndoLISAは96ウェルのマイクロプレート上で測定します。
2×6ウェルは標準検量線(2回測定)に使用しますので84ウェルが試料用に残ります。
試料はそのものとスパイクされたもの(標準添加)を2回ずつ測定することを推奨します。
検量線、規則で必要なコントロールをも含めて1プレートあたり21検体の測定が可能です。

Q10:測定に必要な試料量はどのくらいですか?

A10:
試料量はウェルあたり100ul必要です。
コントロールのスパイク測定と2回測定がありますので適宜に希釈された試料が400μl必要です。

Q11:EndoLISAキットにβ-グルカン阻害剤が含まれていないのはなぜですか?

A11:
EndoLISAはエンドトキシンと特異的に反応しますがβ-グルカンとは反応しません。
それ故、EndoLISAによるエンドトキシン測定ではβ-グルカンによる正の誤差はありません。

Q12:EndoLISAの検出下限値はいくつですか?

A12:
EndoLISAの測定範囲は0.05-500 EU/mlです。
EndoLISAの感度に関する利点は試料を希釈せずエンドトキシンを検出することでLALでは1000倍希釈が必要な場合もあります。

Q13:スパイク回収率の計算はどのようにするのですか?

A13:
[(スパイク試料中のエンドトキシン量)-(試料中のエンドトキシン量)]/(添加したエンドトキシン量)×100%
例)スパイク量:5EU、試料:10EU、スパイク試料:14.5EU
 (14.5EU-10EU)/5EU×100=90%

Q14:エンドトキシン単位(EU)は質量単位でどのように換算されますか?またその逆は?

A14:
経験則で1EUは100pgのエンドトキシンに相当すると言われます。
(但しエンドトキシンの活性は細菌株によって大きく異なります。)

Q15:EndoLISAで測定できないようなものはありますか?

A15:
EndoLISAは広範囲の製品タイプや成分にうまく対応しています。
下記のテスト済成分リストを参考にしてください。
ただし自然に蛍光を発する物質は蛍光測定そのものに影響を与えます。
エンドトキシンが血液でマスクされるためEndoLISAでの血液や血漿試料の測定は推奨しません。
多種類の製品があるため個別にスパイク回収率をテストされることをおすすめします。

表1.LPSスパイク回収率が有効な物質の最高許容濃度 LPSスパイク回収率が有効な物質の最高許容濃度

EndoLISAとLALアッセイとの比較
試験物質はそれぞれの溶媒で溶解され、希釈系列の試料が純水または0.1M NaClで調製され
5EU/ml LPS(E.coliO55:B5)がスパイクされました。
EU/mlとスパイク回収率が計算されました。
有効なスパイク回収率基準は50-200%でした。

Q16:EndoLISAで血液/血漿/血清中のエンドトキシン(LPS)を検出できますか?

A16:
EndoLISAによる血液試料の測定は推奨しません。
エンドトキシンが血液でマスクされ測定値が信頼できません。
LALアッセイでも同じです。

Q17:EndoLISAのMSDSはありますか?

A17:
キットの試薬類には危険性はないと考えられていますが
MSDS(製品安全データシート)が必要であればダウンロードできます。