変異解析手法をもちいた各種分析論文例

高分解融解曲線解析によるインフルエンザAウィルスのサブタイプの迅速同定および新たに出現する変異の検出について検討した。ウイルスマトリックス遺伝子をLightCyclerリアルタイム逆転写PCR（RT-PCR）によりLCGreen I蛍光色素存在下で増幅した。

アッセイ条件を最適化すると、インフルエンザAウイルスの主なサブタイプであるH1N1、H3N2、H5N1、H7N3、H9N2はこの方法で増幅され、PCR産物は179bpであった。In vitro転写により得たH3N2 RNAを用いたRT-PCRにより、RNA濃度の直線定量範囲（相関係数=0.9935）は8桁にわたり、ウイルスRNAの検出下限は103コピーであった。

PCR産物のHRM解析はHR-1で行い、融解曲線の形をウイルスサブタイプのフィンガープリントとして扱った。ウイルスのサブタイプは、検体より分離したウイルスと対照ウイルスのPCR産物で形成されるヘテロデュプレックスの融解曲線の微分プロットから同定した。

融解プロファイルはアッセイ間の変動も小さく一定していた。そこで、この5種類のインフルエンザAウイルスのサブタイプを同定するためのHRMのデータベースと実験プロトコールを確立した。

21検体から分離したインフルエンザAウイルスにこのプロトコールにより解析したところ、赤血球凝集素に特異的なプライマーセットを用いたRT-PCRの結果と一致した。検体から分離した配列変異(n=4)もHRM分析スキームで明らかになった。このアッセイはインフルエンザAウイルスのサブタイプ同定とウイルス変異をスクリーニングするための、マルチプレックスやハイブリダイゼーションプローブを必要としない、新しいウイルス検査の手法である。