LightScanner™およびLightScanner32によるジェノタイピング法の比較：
スモールアンプリコン法、LunaProbe法、スナップバックプライマー法
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【はじめに】
スモールアンプリコンジェノタイピング（SAG）法とLunaProbe法はよく確立されたジェノタイピングの手法である。SAGアッセイではプライマーは等しい濃度で使い、標的配列を均等に増幅させる。LCGreen Plus色素存在下、スモールアンプリコン（40-100bp）を熱変性させると融解ピークが得られる。
LunaProbeアッセイでは非標識プローブとして働く3’をブロックしたオリゴヌクレオチドと、アンプリコンサイズが80-200bpとなるようなプライマーを使う。プローブからの十分なシグナルを得るため、プライマーの濃度に差を持たせてプローブのターゲットとなるフラグメント鎖が偏重して増幅するようにする。これにより、LunaProbeが一本鎖コピーにハイブリダイズするようになり、アレルの違いを区別することができるプローブの融解曲線が得られる。
スナップバックプライマーはジェノタイピングの新たな方法として有望である。スナップバックアッセイは2つのプライマーを用い、LunaProbeアッセイに似ているが、一方のプライマーの5’末端にプローブに相当する部分が結合している。このプローブ部分は標的SNP領域に相補的であり、LunaProbeと同じ仕組みでアレルの違いを識別する。LunaProbe法もスナップバックアッセイ法もプローブの融解領域（相対的に低いTm）とアンプリコンの融解領域（相対的に高いTm）が現れるが、SAGアッセイで融解領域は一つである。
【まとめ】
本報では、まずLunaProbeアッセイのプライマーをデザインした。そして、同一プライマーを用いてスナップバックアッセイに改変した。3通りのいずれの方法でも正しくジェノタイピングできた。
アレルを最もよく分離したのはLunaProbe法で、次いでSAG、スナップバック法であった。アッセイを成功させる鍵はプライマーのデザインである。プライマーが適切かどうかを判断するにはアニーリング温度のグラジェントPCRを行う。適切なアニーリング温度の範囲が広く、一つのアンプリコンのみ得られるプライマーであれば、どの方法にも使える。
