Hi-Res Meltingに用いられる4種類のdsDNA結合色素を用いたマスターミックス5商品の比較
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【目的】
Hi-Res Melting™のアプリケーションを実施するのに市販のマスターミックスを使うことは便利で経済的な手段である。初めて市販されたHi-Res Meltingのためのマスターミックスは二本鎖DNA飽和結合色素LCGreen®Plusを含むLightScanner® マスターミックス（Idaho Technology, Inc）である。
最近、EvaGreen®（BiotiumおよびBioRad）、SYBR®GreenER™（Invitrogen）、LightCycler®480 ResoLight (Roche)も使われるようになった。本報では、これらのマスターミックスのHi-Res Meltingアプリケーションへの適用性を検討した。ヘテロ接合変異検出のためのラージアンプリコン遺伝子スキャニング、スモールアンプリコンジェノタイピング、LunaProbe™ジェノタイピングについて検討した。
【結果】
LIPCの302bpのフラグメントを使ってラージアンプリコン遺伝子スキャニングについて検討した。LCGreen PlusとResoLightマスターミックスでは正しく7つのジェノタイプを検出できたが、EvaGreenとSYBR GreenERマスターミックスでは、ホモ接合変異が誤って野生型と判定され、異なるヘテロ接合のジェノタイプが同一と判定されたため、5つの型に分類された。
OTCのA:T多型（隣接配列対称）についてLunaProbeジェノタイピングで検討したところ、SYBRGreenERを除いてすべてのマスターミックスで正しくジェノタイピングされた。ResoLightマスターミックスでは、正しくジェノタイピングをするのに十分なシグナルを得るために、プライマー量の非対称性を大きく（10:1、他のマスターミックスでは5:1）する必要があった。LCGreen Plusで最も強いプローブ：アンプリコンの融解シグナルが得られ、他は最小限度の強度であった。
CPS1のA:T多型についてスモールアンプリコンジェノタイピング法で検討したところ、ヘテロ接合はすべてのマスターミックスで検出できた。LCGreen PlusとEvaGreen（BioRad）のみ正しくホモ接合を検出した。
THO1のSTRをジェノタイピングした。STRに直ぐ隣接するプライマーを用いて得られるフラグメントは67-82bpの長さになる。16検体の8つのジェノタイプを正しく同定できたのはLCGreen Plusのみであった。
アレル存在比の異なる試料（C:T置換）を調製して、LunaProbeジェノタイピングによりどの程度の量を検出するか検討した。SYBR GreenER、EvaGreen（Biotium）、ResoLightではプローブとマッチするアレルの存在比が25％までであったが、EvaGreen（BioRad）では10％、LCGreen Plusは5％まで検出した。
